细胞培养技术是细胞生物学研究方法中重要和常用技术，通过细胞培养既可以获得大量细胞，又可以借此研究细胞的信号转导、细胞的合成代谢、细胞的生长增殖等。

微血管内皮细胞培养方法

方法一

步骤如下：

取体质量60-70g雄性SD大鼠

无菌条件下取出大脑

放预冷DHank′s中

剥离软脑膜、大血管及大脑髓质

收集大脑皮质,剪碎成1mm3的小块

移入匀浆器中匀浆,将匀浆液依次通过80目和目尼龙网过滤

收集目尼龙网上的微血管段。用0.12%胶原酶37℃消化20min

冲洗液冲洗2遍,离心所得沉淀用配制的内皮细胞完全培悬浮后

接种于明胶预先包被的培养瓶中,37℃,5%CO2培养箱中静置培养

约6-7天细胞基本融合成片后,用%胰蛋白酶+%EDTA消化,进行传代

方法二

选用DMEM高糖培养基

1.取5-7天大鼠心脏，用PBS洗净血液

2.用75%乙醇浸泡30s

3.用PBS冲洗后，剪碎，用适量0.5%胶原酶在37度摇摆水浴中消化30min，加入适量0.02%胰蛋白酶，用吸管轻轻吹打，37度水浴中消化30min。

4.分离下的细胞过目筛网，过滤液用20%小牛血清DMEM培养基混悬离心（转/min，5min），未过网的弃之。

5.所得细胞悬于20%小牛血清DMEM培养基，并调整细胞浓度到-/ml，接种于0.2%明胶预处理的培养瓶中37度培养4小时，以去除未黏附细胞，更换含50mg/L肝素、10mg/L内皮细胞生长因子的DMEM完全培养基培养。

6.每3-4天换液一次，直至长成细胞单层，选3-4代传代内皮细胞，0.25%胰蛋白酶消化备用。

小鼠心肌细胞培养方法

1.制备心肌细胞用出生一天的乳鼠最好。2.制备心肌细胞用试验方法书上的方法，取心尖部用PPS洗清，要剪粹0.1mm，注意器械无菌。3.培养基有进口的DMEM，用20%的胎牛血清，加双抗，注意操作的无菌。4.用分次消化法，在此37度的摇床中进行分次消化法，消化时间要把握好，不然大过，吹打要把握好。5.消化好后直接接种于96孔板中进行试验备用，离心的速度不能大快，否则心肌细胞就会有很多死细胞。6.我用二次差速的方法来纯化心肌细胞，每次1.5小时，差速后的细胞种在96孔板中并加上一定量的杀非心肌细胞的物质，三天，经研究加五天也行对细胞没有很多影响。

7.心肌细胞有大部分的心肌纤维细胞和心肌细胞，而心肌细胞又分为M心肌细胞和F心肌细胞，我们用于研究用的心肌细胞最好用M心肌细胞，因为M心肌细胞跳动很明显。8.要很好的把握好试验的时间

心肌细胞培养方法详述配液：Hanks液、低糖DMEM液、高糖DMEM液、胰酶消化液、双抗液、碳酸氢钠液、盐酸液。

取鼠：鼠盆用棉铺好，取鼠。准备：事先检查显微镜、磁力搅拌器及离心机是否好用，提前三小时把胎牛血清、胰酶、抗生素拿出来化开。其余未冻药品也提前20分钟拿出来缓和一下。新洁尔灭（0.1％）泡纱布（用10ml5％的新洁尔灭加水至ml即得），消毒地面（1：的84液）。用酒精棉球擦拭台面后把物品摆放好，开紫外线灯照30分钟后开鼓风机吹至实验结束。物品：白大衣、饭盒、小剪子、小镊子（4套）（一套剪皮肤、一套开胸取心，一套剔除心缘纤维组织，一套剪碎心脏）、瓶皿（2套）[两个小圆培养皿，培养皿内加DMEM液，先后装取出的心和剔出纤维组织后的心][一个小烧杯装碘酒和酒精棉球]、ml烧杯3个[一个用于水浴，事先加好水，最好是一或二蒸][一个装0.1％新洁尔灭ml左右，消毒小鼠]、ml烧杯1个，用作废液缸、50ml烧杯3个（剪碎心肌组织，最后配液）、三角烧杯（50ml）+小转子（小转子，酒精擦，双蒸水冲后，再把酒精彻底冲掉后用三角烧杯高压）；离心管及帽（12-14个），两个试管吸管（5~8个）大镊子（两把，持物，例夹棉球等）

台面：磁力搅拌器、纱布（事先用于托盘装0.1％新洁尔灭浸泡）、试管架、泡沫塑料板、五个针头（不用消毒）75％酒精棉球及碘酒（消毒棉球，泡酒精、碘酒）大镊子两把（一把夹棉球，一把取鼠）、3个ml烧瓶（一个装一蒸水，一个装新洁尔灭，另一为空的备用）1个ml烧瓶（废液缸）、温度计、PH试纸（事先调PH值）、酒精灯、打火机/火柴、载玻片（5-10个）[用于培养前看接种密度及消化后看细胞密度]、注射器5ml6个（胰酶、DMEM、胎牛血清）1ml2个（双抗液）20ml备用2个、微量加样器ml及ml

以上物品均用紫外线照30分钟。

另外准备手套、帽子、口罩、24孔培养板、离心机+一把小锁、未冻药品及DMEM、NaHCO3、胎牛血清。事先把显微镜、离心机、磁力搅拌器电源插好。检查酒精灯是否有酒精，碘酒和酒精棉球是否够用。先把物品递入，后穿大衣、帽子和口罩。然后把酒精灯打开，把瓶皿摆好，再用一个瓶皿装酒精棉球。

培养过程：

1.把两个5ml注射器分别插入DMEM和胰酶中，分别向两个圆皿中加入5ml的DMEM培养液。用一把大镊子从鼠盆里取出一只生后2~3天的SD大鼠，放入0.1％新洁尔灭浸泡一下后拿出放在泡沫板上，用针头把鼠固定（位置摆正），用另一把大镊子取碘酒棉球擦皮肤，再用酒精棉球脱碘，取一把小剪子及小镊子开皮，充分撕拉开，再用酒精棉球消毒，后换另一把小剪子和镊子在剑突处正中线稍偏左开胸取心。2.取出的心放在刚才准备的一个装有DMEM的圆皿中再取下一只。重复以上过程。（鼠全部杀死后，把取鼠镊及泡沫板、新洁尔灭缸等拿**面。消毒、清洁，铺纱布、换手套。3．用第三副剪子和镊子把圆皿中的心脏周边的血凝及纤维组织剔除掉，放在另一个预先装好DMEM的圆皿中。抽取5ml的胰酶，然后将其中少许放入50ml的小烧杯中，大部分倒入三角烧瓶中。用第四副剪子将烧杯中的心脏剪成1mm3的碎块，倒入三角烧瓶中（可用剪刀刮入），再用剩余胰酶刷净烧杯。

4．把温度计和三角烧杯放入ml烧瓶中，（事先调好水量，多会没过三角烧杯，少温度会不均匀）。打开磁力搅拌器电源，调温度（使-缓慢加到34~35℃）和转速（转速不可过快，否则会打碎细胞，基本上标志为平行）。一定要注意监控。5．温度达到34℃时开始计时，第一次为10分钟，以后可为8分钟，事情况而定。在此期间，在试管架上摆上5、6个离心管，标上1、1，2、2。其中在1号两管事先加入DMEM液各2毫升6．10分钟后，把三角烧瓶取下，磁力搅拌器关上，用一个吸管轻轻吹打（使消化下来的细胞彻底从组织团快上掉下来），这个吸管（1）用后固定放在一个离心管中，以后每次消化后取下都用其吹打几下，第一次上清弃去，然后向两个1号管分别倒入2ml上清（尽量不要把组织倒出，也不要剩液太多，以免消化下的细胞重复消化造成损伤），用另一个吸管（2）混匀配平两个管（即两个管水平高度相同），轻轻吹打，以免损坏细胞。7．接着把这两个离心管放入离心机中，调10分钟，或转，垫小锁，打开关。8．同时向三角烧瓶中加入5ml胰酶，继续消化8分钟，注意控制温度。此时向两个2号管中分别加入2mlDMEM液。9．取下三角烧瓶，仍用1号吸管吹打，后静置片刻向两个2号管分别倒入2毫升的上清，取出两个离心后的1号管，把上清液沿细胞贴壁一方慢慢倒掉，后向其中一管加入4ml的DMEM液，用2号吸管取少量液体加入另一个离心管中，把管底的沉淀细胞洗下来，把液体全部移入其中一管，三个管（1个1号管，两个2号管）配平，放入离心管中，离心十分钟。同时仍加5ml的胰酶，放入三角烧瓶中，继续消化（注意控制温度，达34℃时计时）。

10．消化到4次左右，吹打均匀后，吸一滴滴在载玻片上，拿到镜下观察消化情况，决定消化次数。

11．离心2次的吸管，放在试管架上，待离心过程全部完事后，把各管上清液倒掉，在各管加上3ml（不用精确，大致这样）DMEM液，记住共加入多少DMEM液的量，换吸管（3号）把各管底细胞块吸下吹打均匀后，移入50ml烧杯中，然后用注射器抽取余量的DMEM加入烧杯中，加入小牛血清及抗生素，换吸管（4号）吹打均匀。12．取出24孔培养板，一个人吹打，另一个人用加样器加药。封盖时过火，盖上盖，放在CO2孵箱。24小时后观察是否贴壁。（24孔板，每孔最多加2ml，一般加液时每孔加1~1.5ml）

配药：天平、量筒、烧杯、玻璃棒、二蒸水、硫酸纸。

NE：加样器μL大头一个或1ml注射器一个，50μL小头一个。量筒ml，烧杯毫升。

配法：抽取0.85mlNE液，放入烧杯，再加二蒸水99.15ml补足至ml，备用。在工作台内，用针头滤器滤过（仪器：针头滤器及膜，先试膜，再高压消毒，注意压力），在一个新的ml烧杯内。取4个50ml的烧杯，分别标号1、2、3、4。然后用加样器（μL）分别取0.1mlNE放入3、4杯内。

小牛血清：先配初液，即0.4ml/10ml（用低糖DMEM配，0.4ml牛血清需μL加样器一个）。配成后即为4％的浓度。分别取0.1ml放入1、2、3、4号的50ml的烧杯内。

抗生素：分别取0.1ml放入1、2、3、4号的50ml的烧杯内。

分别向1、2、3、4号的50ml的烧杯内加入DMEM。各为9.7ml、9.7ml、9.6ml、9.6ml。用4个吸管吹打均匀，然后用加样器每组加1.0ml。另一人用吸管吸出培养液。每组换一个大头。

人关节软骨细胞的体外培养

具体操作步骤如下：

1．无菌条件下取材（术中切除的全层软骨片），于含无血清的DMEM培养液的无菌容器中保存，低温下转移（冰盒），移入超净工作台，PBS冲洗3次。剪去非软骨组织如滑膜组织或纤维结缔组织。

2．收集全部软骨，移入50ml离心管中。用10mlPBS洗软骨组织碎块2－3遍。在离心管内再加入新鲜的0.25％的胰蛋白酶（10ml/g），37培养箱中消化30－45min（最好在搅伴状态下），以除去可能附着的成纤维细胞。加入等量的10％DMEM终止消化，吹打后去除胰蛋白酶和成纤维细胞，再各用10mlPBS清洗两遍。

3．将软骨移入培养皿，倒入PBS淹盖标本为止，用无菌刀片将软骨片切成1mm3大小的碎粒，移入第二个50ml离心管中，PBS淹盖，冲洗3次。（标本要稍多一点，至少大于mg试验取1g左右，软骨块要尽量切碎，便于消化）

4．加入5ml的0.2％的II型胶原酶，37培养箱中消化4-6h,其中2h后每隔20min晃动离心管一次，观察软骨块基本被消化，悬液变混浊。（II型胶原酶消化4-6h见悬液变混浊，表明已有软骨细胞消化下来，可先收集，未消化完的的软骨碎粒可继续消化，0.1％的II型胶原酶过夜约18－24h）

5．目滤器过滤收集悬液（用PBS冲洗滤器底和皿底尽可能收集所有细胞），彻底打匀成团的细胞。

6．r/min离心10min，弃上清液，PBS重悬3次，相同条件再离心，弃上清液去除胶原酶，收集细胞。

7．加入10％DMEM培养液1ml，吹打均匀后移入10cm培养皿中，补足培养液至10ml。（吹打后可行计数板计数及台盼兰活性检测，或以2.5x/cm2的比例置于培养皿中。）

8．48h后首次换液去除未贴壁的细胞。

9．置于％CO2培养箱内继续培养，每隔3－4d换液1次，倒置显微镜下观察拍照。

10．细胞长满近融合时用0.05%胰蛋白酶－0.02%EDTA消化2－3min，1r/min离心5min，弃上清液，计数，按1：3或1：4传代。（推荐1：2传代）如果组织量多，可重复4－8步骤。

大鼠原代肾小管上皮细胞培养扩增方案

取材：

1.肾小管节段的分离(机械网筛滤过法)：

①取Wistar大鼠断颈法处死，立即置入碘伏液中浸泡5分钟。

②将大鼠转移入超净工作台，取腰部切口迅速取出肾脏，置于盛有生理盐水的培养皿中清洗并除去包膜和肾蒂组织。

③取皮质置于80目筛网上，剪碎成1-2mm3大小组织块，网下放盛有少量生理盐水的培养皿。

④用玻璃注射器内芯于80目网上充分研磨组织。

⑤收集80目网下液体转移至网筛上，用生理盐水冲洗。

⑥将目网上组织用生理盐水冲洗入另一培养皿中，收集置入离心管中。1转/分钟离心5分钟，弃去上清。

2.肾小管节段的消化及培养

①用1.5ml0.25%胰蛋白酶重悬沉淀，37℃温箱中消化约10分钟。

②加入3ml(双倍量)含有10%胎牛血清RPMI中止消化，1转/分离心8分钟，弃上清。

③加入约3mlRPMI悬浮沉淀，并用吸管充分吹打混匀，接种于培养瓶中。

④分离肾小管节段接种于培养瓶后，第一天加入少量培养基，置入37℃,5%CO2孵育箱中静置培养。

⑤培养过夜后，第二天加入足量的培养基，静置培养。

⑥培养72小时后首次换液，以后每两天换液一次。

⑦约第六到七天细胞生长基本融合成单层。

大鼠成骨细胞（OB细胞）的培养方法

1）组织块法取大鼠成骨细胞：将新生SD大鼠(72h内)5只浸泡在体积分数75%乙醇烧杯中3-5min，无菌条件下剪开头部皮肤，取出颅骨，放入盛有D-Hanks(含青霉素3×U/L、链霉素3×U/L)缓冲液的培养皿中，刮去骨膜及骨缝间结缔组织，剪成约1mm×1mm大小的骨片，以D-Hanks液洗3次，加入等量0.25%胰蛋白酶消化10min，加入含体积分数10%新生小牛血清的DMEM培养液终止消化，然后将碎骨片均匀接种于培养瓶中，翻转培养瓶置于培养箱中，3h后转正培养瓶。21d后换液，细胞长满瓶后传代培养。

2）胶原酶消化法：取新生SD大鼠(72h内)5只，即SD乳鼠浸泡于体积分数75%乙醇的烧杯中消毒3-5min，无菌条件下剪开头部皮肤，取出颅骨，放入盛有D-Hanks(含青霉素3×U/L、链霉素3×U/L)缓冲液的培养皿中，刮去骨膜及骨缝间结缔组织，剪成约0.5mm×0.5mm大小的骨片，以D-Hanks液洗3次，加入等量0.25%胰蛋白酶消化10min，弃掉胰酶，加入消化液10只/2.5mL(Ⅰ型胶原酶5mg、透明质酸酶2.5mg，DMEM培养液配制)，37℃恒温条件消化20min，每5min摇匀1次，让消化液与骨片充分接触。吸走弃掉消化液，再加入2.5mL消化液在37℃恒温条件下消化90min。用等量含血清培养液终止消化，将消化液转移至离心管中。用培养液将骨块洗3次，吹打骨块，同样转移液体到离心管中。离心r/min，6min沉淀细胞，含血清培养液重悬细胞，放入体积分数5%CO2饱和湿度条件下于恒温培养箱37℃培养。差速贴壁法纯化成骨细胞，待细胞长满瓶底传代培养。

3）分段胶原酶消化法：取新生大鼠(72h内)5只，即SD乳鼠浸泡于体积分数75%乙醇的烧杯中消毒3-5min，无菌条件下剪开头部皮肤，取出颅骨，放入盛有D-Hanks(含青霉素3×U/L、链霉素3×U/L)缓冲液的培养皿中，刮去骨膜及骨缝间结缔组织，剪成约0.5mm×0.5mm大小的骨片，以D-Hanks液洗3次，加入等量0.25%胰蛋白酶消化10min，弃掉胰酶，加入消化液10只/2.5mL(Ⅰ型胶原酶5mg、透明质酸酶2.5mg，DMEM配制)，37℃恒温条件消化20min，每5min摇匀1次，让消化液与骨片充分接触。吸走弃掉消化液。再加入2.5mL消化液。37℃恒温条件消化20min，收集细胞悬液，离心r/min，5min沉淀细胞，将上清转移至骨片继续消化重复6个循环。每次沉淀的细胞都要用含血清培养液重悬。最后将所有细胞悬液收集离心，含血清培养液重悬，放入体积分数5%CO2饱和湿度条件下于恒温培养箱37℃培养，差速贴壁法纯化成骨细胞，待细胞长满瓶底传代培养。

4）结果：酶消化分离所得细胞接种于培养瓶，24h后细胞充分伸展，呈梭形、三角形或不规则多边形。植块法细胞围绕骨片生长，细胞呈长梭型。培养2d后，胶原酶消化法获取的成骨细胞呈现多边形并有长突起，见图1；组织块法获取的成骨细胞呈现长梭状并有长突起，见图2。分离细胞皆有成骨细胞典型特征。

MIN6细胞培养方法

细胞培养首先分为原代培养和传代培养

原代培养需要从组织中消化、分离、纯化出单细胞,然后继续进行传代、冻存

传代培养首先：

细胞复苏:

1.应遵守慢冻快融的原则.先将水温锅调至37-38度,取出冻存的细胞迅速放入后交细胞面浸至水面以下不断摇动至融化.

2.在无菌台内将完全培养基加入培养瓶内,然后用无菌吸管从冻存管内取出细胞,置培养瓶内轻轻摇晃,使细胞均匀后置培养箱内培养,24h后换液；也可复苏当时离心（rpm5min左右）后,完全培养基重悬培养,适时换液。

细胞传代:

1.贴壁细胞:

对于贴壁细胞应先吸(倒)尽培养基,吸的越干净越好,以免中和后加入的消化液,使强度减弱.PBS清洗2-3次,去除血清和死细胞,50ml培养瓶加入消化液约0.6ml,按此比例进行消化,(根据配制强度经验),晃动使消化液铺均匀置37度培养箱约2分钟,镜下见细胞收缩变圆或少数脱落后,轻轻振动瓶底使细胞全部脱落,加入2-3ml完全培养基后,轻轻吹打,使细胞基本成单个悬浮,然后收集离心（rpm5min左右）,新鲜培养基重悬沉淀,加入完全培养基后继续培养或实验.

2.悬浮细胞:

一般传代可直接将细胞原液分置其它培养瓶内,加入完全培养基继续培养,如要高浓度或需更换新培养基,可先离心（rpm,5min左右）后加入完全培养基,轻轻吹匀后,分置其它培养瓶内加入完全培养基继续培养.

原代成骨细胞培养方法

成骨细胞的分离培养及传代：

将SD乳鼠置入75%酒精中浸泡5min。

于超净台上取顶骨

放入PBS皿中,刮除附着组织,待骨质发白、透亮,再放入PBS

小瓶反复冲洗,换液3次,以0.1%Ⅰ型胶原酶消化30min后吸弃酶液,再以PBS冲洗3次

加入0.1%Ⅰ型胶原酶,将骨剪成1mm2大小,放置15min

后加入与酶液等量的含15%小牛血清的DMEM培养基,吸取上清液,以r/min离心10min

将下层液接种于50ml培养瓶,离心液去上清后接种于25ml培养瓶,

分别加入上述培养基,置入37℃、5%CO2、饱和湿度培养箱内。

每2日换液1次,待细胞长满后,用0.25%胰蛋白酶消化,按1∶2比例传代。

牛眼晶体上皮细胞培养方法

培养方法：

1.市场取牛眼，剪去周围的结缔组织，然后放于1/0U庆大液中，30分钟消毒。

2.超镜台中，将牛眼取出,D-Hanks液清洗3次,剪刀从角巩膜缘后5mm左右处剪开巩膜，环形剪开眼球，将角膜、虹膜等眼前节组织去除，暴露晶体。

3.将悬韧带剪断，取出晶体，从赤道部靠下一点环形剪开晶体，镊子取下前囊膜，将囊膜面朝上，放于培养皿中。

4.加入0.25%的胰酶消化，消化过程中可以用吸管轻微吹打，消化时间8－15分钟左右。然后加入血清培养基中止。

5.直接将消化后的液体加入培养瓶中培养，细胞贴壁，3天后换液，6－7天传代，然后细胞就可以用于实验使用。

总结：

1.我觉得培养用的牛眼不一定需要胎牛或小牛眼，成年牛眼一样是可以做出来的，而且细胞的形态和状态都还不错，成年牛眼我已经养出好几次了

2.培养方法问题，以前都是用组织块培养法，但是我觉得效果并不是很好，而且周期比较长，消化法更容易培养出细胞。

3.有人推荐用胰酶＋EDTA消化，然后离心。个人感觉就用胰酶消化即可，就可以省去离心这一步，减少细胞丢失，可以直接将消化后液体加入培养瓶培养。

4.消化时间非常关键，时间长短如果控制不好，将会导致整个实验的失败。个人认为时间要自己摸索，和实验室条件，胰酶的情况有关，个人感觉最好不要超过15分钟，那样将会导致细胞漂浮，死亡，不容易贴壁。消化温度，如果天气较热，就在室温下即可。较冷，可以放在培养箱中孵育。

作者：海星生物

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